釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又稱面包酵 母、出芽酵母，是與人類關系最廣泛的一種酵母，也是 發酵中最常用的生物種類。釀酒酵母在麥芽汁瓊脂培 養基上菌落為乳白色、有光澤、平坦、邊緣整齊，無性繁 殖以芽殖為主。在生理特性方面，能發酵葡萄糖、麥芽 糖、半乳糖和蔗糖，不能發酵蜜二糖。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

從吉林市昌邑區左家鎮中國農業科學院特產研究 所野生山葡萄園（ZJ）、吉林市昌邑區左家鎮農大紅山葡萄園（NDH）、通化市柳河縣青木原山葡萄基地 （LH），分別采集成熟的山葡萄樣本和山葡萄園土壤樣 本各 3 份，樣本總計 18 份，裝入無菌袋中常溫保存，立 即進行實驗室菌種分離鑒定。

1.2 儀器與試劑

恒溫培養震蕩器（ZDP-250，上海精宏實驗設備有限公司）；微生物培養箱（DHP，上海一恒科學儀器有限 公司）；生物安全柜（Thermo 1300 Series A2）、PCR 儀 （Veriti）〔賽默飛世爾科技（中國）有限公司〕；臺式冷 凍離心機（5415R，德國艾本德股份公司）；凝膠電泳 儀（Bio-Rad PowerPac HC）、紫外凝膠成像儀（BioRad Gel Doc TM XR+）（美國伯樂生命醫學產品有限 公司）。 麥芽汁培養基（青島海博生物技術有限公司）； 酵母粉、蛋白胨（英國 Oxoid 公司）；酵母基因組 DNA 提取試劑盒、LA-Taq DNA 聚合酶、DNA Make〔r 寶生物工程（大連）有限公司〕；其他試劑均為國 產分析純。

2 方法

2.1 菌種的篩選

麥芽汁固體培養基：麥芽汁培養基 131 g、瓊脂粉 20 g，加蒸餾水至 1 L，121 ℃滅菌 30 min，然后倒入平 板，冷卻后 4℃保存備用。YPD 液體培養基：2%葡萄 糖、2%蛋白胨、1%酵母粉，121℃滅菌 30 min，冷卻后 4 ℃保存備用。 稱取每份山葡萄樣本 10 g，置于無菌研缽中研磨， 將山葡萄汁轉入 100 mL 滅菌蒸餾水的三角燒瓶中充 分振蕩 15 min；稱取采集的土壤樣本每份 1 g，加入至 9 mL 的滅菌蒸餾水中，充分振蕩 10 min，靜置 5 min。 分別 10 倍梯度稀釋山葡萄汁水溶液和土壤水溶液至 10 4、10 5，取稀釋液 100 L 涂布麥芽汁固體培養基 平板，28 ℃倒置培養 3 d，觀察菌落生長情況。

2.2 菌株的分離優化

挑取麥芽汁瓊脂培養基中生長情況良好的單菌 落，轉移至含有 50 mL YPD 培養基的三角燒瓶中，12 層紗布封口，30 ℃、180 r/min振蕩培養 36 h，測定細菌 生長濃度 OD600 值。

2.3 菌株理化性質鑒定

糖發酵實驗對分離的菌株進行理化性質鑒定。

2.4 酵母基因組的提取

取 1~2×10 8 酵母菌的過夜培養液至 1.5mL 的 Microtube 中，12 000 r/min 離心 1 min。棄去上清，加 入 500 L 的 GenTLE Yeast Solution A，輕微振蕩重懸 沉淀，37℃溫浴 1 h，期間輕輕振蕩離心管數次。加入 100 LGenTLE Yeast Solution B，輕微振蕩混勻，70 ℃ 溫浴 10 min。加入 200 LGenTLE Yeast Solution C， 輕微振蕩混勻，冰浴 5 min，12 000 r/min 4 ℃離心 5 min。取上清于新的離心管中，加入 1/2 體積的異 丙醇，上下顛倒離心管充分混勻，12 000 r/min 4℃離 心 5min，棄上清。加入 500 L 預冷的 70%乙醇，輕 輕顛倒洗滌沉淀，12 000 r/min 4 ℃離心 5 min，棄上 清。室溫下干燥，加入適量的 TE Buffer 溶解， 20℃ 保存備用。

3 結果 

在采集的各土壤和山葡萄樣本中均有圓潤、白色、 整齊、形態較好的單菌落生長。挑取其中生長良好的單菌落共計 27 個菌落，轉入 YPD 液體培養基中進行菌株分離優化，測定 24 h 和 36 h 的生長速度，以 OD600 計算。其中， 編號為 ZJ-02、ZJ-06、NDH-01、NDH-05、NDH-09、 LH-03、LH-05、LH-06 和 LH-08 共 9 株菌生長情況較 差，后續研究將這 9 株菌舍棄。分離的 18 株酵母菌 26S rRNA D1/D2 區基因序 列經過 PCR 克隆和測序后，在 NCBI GeneBank 數據 庫中進行序列比對，依據分離株與標準株親緣關系，構 建系統發育樹，并對分離株進行分類。

4 結論

山葡萄作為釀酒原料已經有70多年的歷史， 酵母是釀酒工藝中最關鍵的因素之一。本研究 選擇的樣本采集地點位于吉林省內山葡萄優質產區和 種植資源基地，種質優良、資源豐富。從采集的土壤和 山葡萄樣本中經過菌株的分離優化、生理生化試驗和 分子生物學鑒定，成功分離出 18 株酵母菌，其中有釀 酒酵母 12 株、發酵畢赤酵母 3 株、乳酸克魯維酵母 3 株；從樣本分布區域來看，分離出的釀酒酵母大多數為 自然生長酵母菌，占本次分離結果的 66.7%。為釀酒 酵母菌株選育、飼料釀酒酵母產品、有機礦物元素酵母 鐵酵母銅飼料添加劑產品的研究提供了充足的菌種資源。



 

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