慢性阻塞性肺疾病( COPD) 是一種以不完全可 逆的氣流受限為特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重影 響患者的生活質(zhì)量及壽命。目前，其發(fā)病機(jī)制仍 不十分清楚，研究發(fā)現(xiàn)，吸煙是誘發(fā) COPD 的關(guān)鍵因 素之一，而氣管、肺實(shí)質(zhì)與肺血管的炎癥反應(yīng)及結(jié)構(gòu) 重塑是 COPD 的典型病理變化。

1 材料

1. 1 動(dòng)物

50 只雄性 SD 大鼠，SPF 級(jí)，2 月齡，體 質(zhì)量( 200 ± 20) g，合格證號(hào) SCXK( 魯) 2014-0007， 由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供; 實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地 為河南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)為 SYXK( 豫) 2012-0009，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查批準(zhǔn)編號(hào) DWLL20130018。由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限 責(zé)任公司提供動(dòng)物生長(zhǎng)飼料。

1. 2 藥物及試劑

二陳湯加味方組成為姜半夏 10 g( 批號(hào) 1505001S) ，陳皮 10 g( 批號(hào) 1509002S) ，白術(shù) 15 g ( 批 號(hào) 1407001W) ，茯 苓 20 g ( 批 號(hào) 1405002W) ，黨參 25 g( 批號(hào) 1407007W) ，枳殼 10 g ( 批號(hào) 1510002W) ，山藥 20 g( 批號(hào) 1509003S) ，地龍 10 g( 批號(hào) 1511002 S) ，桂枝 3 g( 批號(hào) 1510002S) ， 炒蘇子 20 g ( 批 號(hào) 1512001S) ，炙麻 黃 6 g ( 批 號(hào) 1508001S) ，苦杏仁 10 g ( 批號(hào) 1404002S) ，葶藶子 15 g( 批號(hào) 1506001W) ，均為華潤(rùn)三九醫(yī)藥公司提供 的中藥配方顆粒; 脂多糖( LPS，美國(guó) Sigma 公司，批 號(hào) 025M40400V) ; 大鼠 IL-4 ELISA 試劑盒，兔抗大 鼠 VEGF 一抗，兔抗大鼠 VEGFＲ2 一抗，DAB 顯色 試劑盒( 武漢博士德生物有限公司，批 號(hào) 分 別 為 12812591008，13CM409B，12J24，11I18B22) ; 兔多抗 甘油醛-3-磷酸脫氫酶( GAPDH，杭州賢至生物科技 有限公司，批號(hào) AB-P-Ｒ001) ; 小鼠單克隆抗體 ET-1 ( 英國(guó) Abcam 公司，批號(hào) GＲ270664-3) ; 蘇木素染色 液，伊紅染色液( 北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分 別為 G1140，G1100) ; 紅旗渠過濾嘴香煙( 河南中煙 工業(yè)有限責(zé)任公司，烤煙型，焦油含量 14 mg /支，尼 古丁含量 1. 1 mg /支) 。PCＲ 引物序列由北京擎科 新業(yè)生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，見表 1。

1. 3 儀器

DL-5-B 型離心機(jī)( 上海安亭科學(xué)儀器 廠) ; BA210 型生物顯微鏡( 北京麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán) 有限公司) ; BSA124S-CW 型電子天平( 北京麥多利斯儀器有限公司) ; DB-B1 型烤片機(jī)( 常州國(guó)華電器 有限公司) ; DHP-9050B 型智能型電熱恒溫培養(yǎng)箱 ( 上海瑯實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司) ; TP1020-1 型自動(dòng)組織 脫水處理機(jī)，ST5020 型全自動(dòng)染色機(jī)( 上海徠卡顯 微系統(tǒng)有限公司) ; SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺(tái)( 蘇州 安泰空氣技術(shù)有限公司) ; DYCZ-40 型電轉(zhuǎn)儀( 北京 六一儀器廠) ; QuantStudio 6 型實(shí)時(shí)熒光定量 PCＲ ( Ｒeal-time PCＲ) 儀( 美國(guó) ABI 公司) ; Nano-100 型 微量分光光度計(jì)( 杭州奧盛儀器有限公司) ; JY300 型水平電泳儀( 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司) ; 精宏DHG -9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱( 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司) 。

2 方法

2. 1 分組、模型制備與給藥

50 只 SD 大鼠隨機(jī)分 為 5 組: 正常組、模型組、二陳湯加味低、中、高劑量 組( 10，20，40 g·kg － 1·d － 1 ) 。制備 COPD 大 鼠 模 型，于第 1 天和第 14 天，對(duì)除之外的 40 只大鼠 逐一進(jìn)行麻醉( 腹腔注射 10% 水合氯醛溶液進(jìn)行麻 醉，給藥劑量為 0. 03 mL·kg － 1 ) ，并氣管內(nèi)滴注 LPS ( 1 g·L － 1 ) 0. 2 mL。正常組大鼠氣管內(nèi)注入等量生 理鹽水。除第 14 天外，第 2 ～ 30 天將造模大鼠置入 自制的密封煙熏箱內(nèi)被動(dòng)吸煙，進(jìn)行香煙煙霧染毒， 2 次/ d，中間間隔 4 h，香煙 10 支/次，30 min /次。最 終以病理組織及肺功能的改變?yōu)闃?biāo)準(zhǔn)判斷模型是否 制備成功。模型制備成功之后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行 灌胃，各組大鼠每日用藥分別按照二陳湯加味低、 中、高劑量每日 10，20，40 g·kg － 1換算出免煎顆粒用 量，用純水稀釋后于每天上午 10: 00 及下午 4: 00 分 別灌胃給藥。模型組和正常組灌胃相同體積的純 水，給藥全程持續(xù) 14 d。灌胃劑量換算，二陳湯加味 中劑量組用藥量按照 70 kg 的成年人每日常規(guī)服用 藥量換算，體表面積系數(shù)為 0. 018，確定中劑量后， 低劑量為中劑量的 0. 5 倍，高劑量為中劑量的 2 倍。

2. 2 蘇木素-伊紅( HE) 染色觀察大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化

用濃度為 4% 的多聚甲醛固定大鼠右 肺上葉組織; 選取厚度約 1 ～ 2 cm 的右肺上葉組織 橫截面放入包埋盒中，自動(dòng)組織脫水機(jī)脫水; 先在石 蠟包埋機(jī)上手動(dòng)完成石蠟包埋，保存于 4 ℃環(huán)境下， 6 μm 厚切片使用自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行 HE 染色，封片后 光鏡下觀察大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)。

2． 3 測(cè)定肺血管壁厚度

每組 HE 染色切片中隨 機(jī)選取 6 個(gè)直徑在 200 ～ 350 μm 與呼吸性細(xì)支氣 管、肺泡管伴行的肺小動(dòng)脈，并測(cè)定其肺血管外徑、 管壁厚度、血管總面積及管壁面積，計(jì)算出管壁厚度 占外徑的百分比( WT% ) 和管壁面積占血管總面積 的百分 比( WA% ) ，以此反映肺小動(dòng)脈管壁增厚 程度。

2. 4 ELISA 測(cè)定 IL-4 含量

于空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待 測(cè)樣品孔中加樣并 37 ℃孵育 90 min，棄孔內(nèi)液體并 甩干，加入抗體工作液并孵育 60 min。棄液并洗板 3 次，每孔加酶結(jié)合物工作液 100 μL，37 ℃ 溫育 30 min，棄液甩干并洗板 5 次。每 孔 加 顯 色 劑 90 μL，酶標(biāo)板上加覆膜，37 ℃避光孵育 15 min。加 終止液 50 μL 終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀 450 nm 波長(zhǎng)處檢 測(cè)各孔吸光度 A。

2. 5 Ｒeal-time PCＲ 檢測(cè)

ET-1 mＲNA 含量 取新 鮮冰凍組織約 100 mg，加 trizol 試劑，并研磨裂解。 加入三 氯 甲 烷 200 μL，混 勻 后 靜 置 5 min。4 ℃ 12 000 r·min － 1，離心 15 min，轉(zhuǎn) 移 上 層 至 1. 5 mL EP 管中，加入異丙醇 400 μL，混勻后靜置 10 min。 離心，棄 上 清，加 入 75% 乙 醇 1 mL，混 勻 后 離 心 5 min。棄上清后，于空氣中干燥 ＲNA 沉淀，將其溶 于 20 μL DEPC 水中，取溶解后的 ＲNA 2 μL 用微量 分光光度計(jì)測(cè)定 ＲNA 的純度和濃度。根據(jù) A 計(jì)算 樣品 ＲNA 的 濃 度。逆 轉(zhuǎn) 錄 成 cDNA，反 應(yīng) 條 件: 25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。 Ｒeal-time PCＲ 檢測(cè)，cDNA 做 10 倍稀釋，反應(yīng)條件: 50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min; 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s， 40 個(gè)循環(huán)。繪制熔解曲線，最終以 2 － ΔΔCt 表示。

2. 6 免疫組化檢測(cè)

VEGF，ET-1 及 VEGFＲ2 的表達(dá) 將切片脫蠟水化，以雙氧水封閉，抗原修復(fù)后，滴 入一抗 VEGF，VEGFＲ2，ET-1 工作液，DAB 顯色，并 蘇木素復(fù)染，陽性對(duì)照用已知陽性片，陰性對(duì)照用 PBS 代替一抗。免疫組化呈現(xiàn)棕黃色為陽性判定依 據(jù)。每組切片均隨機(jī)選取 6 個(gè)高倍鏡下的視野，使 用圖像分析軟件 Image-Pro Plus 計(jì)算平均積分吸光度 IA，整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

2. 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)軟件采用 SPSS 22. 0 進(jìn)行 數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布，組間比較采用 One-way ANOVA 進(jìn)行描述，采用 SNK-q 檢驗(yàn)法描述組間兩 兩比較，計(jì)量資料采用x珋± s表示; P ＜ 0. 05 為差異有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)， 正常組大鼠毛皮仍然呈白色并有光澤、呼吸均勻、反 應(yīng)迅速。模型組大鼠呼吸淺快，呼吸困難，易煩躁激 惹，毛發(fā)干燥發(fā)黃，精神差。二陳湯加味高、中、低劑 量組分別以相應(yīng)的藥物灌胃后，大鼠體質(zhì)量增加，二 陳湯加味中劑量組效果最明顯。二陳湯加味低劑量 組在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行期間死亡 1 只，模型組死亡 2 只， 經(jīng)解剖觀察，發(fā)現(xiàn)肺氣腫及肺部感染可能是致死的 主要原因。鏡下觀查肺組織，正常組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺血管 管壁無增厚，支氣管黏膜結(jié)構(gòu)基本完整，上皮細(xì)胞排 列均勻整齊，無變性、壞死，管壁各層無炎性細(xì)胞浸 潤(rùn)、無纖維組織增生。模型組細(xì)支氣管管壁上皮有 多處脫落，黏液下層存在黏液腺增生，管壁各層有大 量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)有較多滲出物，部分細(xì)支氣管周圍可見肺大泡，與之伴行的肺血管可見管壁增厚， 局部肺間質(zhì)增厚，局限性肺不張; 高劑量組肺間質(zhì)增 厚比較模型組減輕; 與模型組比較，中劑量組病理學(xué) 改變較輕，細(xì)支氣管黏膜破壞較輕淺，上皮變性及壞 死不明顯，管腔內(nèi)滲出物少，肺泡內(nèi)少量巨噬細(xì)胞、 部分肺泡擴(kuò)張，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管管壁增厚不明 顯; 低劑量組病理學(xué)變化接近模型組。

4 討論

COPD 可以依據(jù)其咳嗽、咯痰、胸悶等臨床癥 狀，而歸屬于中醫(yī)“肺脹”“咳嗽”“喘證”等范疇，病 機(jī)以肺氣虛為本，以痰氣交阻于肺為標(biāo)，本虛標(biāo)實(shí)。 二陳湯作為祛痰劑的代表方，以燥濕化痰，理氣和中 的功效著稱，方中姜半夏燥濕化痰、和胃降逆，姜制 之后更適于脾虛痰盛及寒痰咳逆; 陳皮理氣健脾，茯 苓健脾滲濕以助化痰，甘草健脾和中、潤(rùn)肺止咳、調(diào) 和諸藥。二陳湯加味方是在二陳湯的藥味基礎(chǔ)上，再加蜜炙麻黃、炒苦杏仁以宣降肺氣、止咳平喘，加 葶藶子以瀉肺降逆，加黨參、白術(shù)、山藥以健脾補(bǔ)肺， 寓培土生金之意; 又加干姜溫肺祛寒，地龍通絡(luò)祛 瘀。諸藥并用，燥濕化痰、止咳平喘通絡(luò)，以使肺氣 得宣，兼 健 脾 固 腎，以 培 護(hù) 根 本。本 課 題 組 基 于 COPD 肺虛痰阻的病機(jī)組方，臨床應(yīng)用時(shí)常根據(jù)患 者肺虛及痰阻的側(cè)重不同而調(diào)整方中具體藥味用 量，但總以二陳湯為基礎(chǔ)進(jìn)行加減。本次實(shí)驗(yàn)中組 方為臨床加減變化時(shí)的基本方，已在前期做了大量 臨床觀察證實(shí)療效顯著，但其中治療的作用機(jī)制仍 待現(xiàn)代研究證實(shí)。