杭白菊 Dendranthema morifolium 又名白菊花， 是享有盛譽(yù)的“浙八味”中藥植物之一。浙江省桐鄉(xiāng) 市從明末開始就種植栽培白菊花，至今已有幾百年 的種植歷史，為國(guó)家原產(chǎn)地保護(hù)的特產(chǎn)，2015 年總 種植面積為3 000 hm2 ，產(chǎn)量為0.91萬(wàn)t，約占全國(guó)總 產(chǎn)量的60%，是當(dāng)?shù)貎?yōu)勢(shì)特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)和農(nóng)民增收 致富的重要經(jīng)濟(jì)來(lái)源（沈瑤等，2017）。隨著杭白菊 產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因農(nóng)藥殘留引起的質(zhì)量安全問(wèn)題逐漸 暴露出來(lái)，已成為制約該產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的關(guān)鍵 因子之一。

供試病樣及植物：2015—2016年從浙江省桐鄉(xiāng) 市采集具有典型葉枯病癥狀的現(xiàn)蕾期杭白菊植株用 于病原菌的分離鑒定及后續(xù)抗藥性測(cè)定；同時(shí)于浙 江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū)農(nóng)作園內(nèi)種植健康的杭白菊， 用于測(cè)定分離病原菌的致病性。 供試藥劑及培養(yǎng)基：98%多菌靈（carbendazim） 原藥，浙江威爾達(dá)化工有限公司。馬鈴薯葡萄糖瓊 脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、 葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L；燕麥片煎 液瓊脂（oat meal agar，OMA）培養(yǎng)基：燕麥片 30 g、 瓊脂粉18 g，蒸餾水定容至1 L。 試劑及儀器：PCR擴(kuò)增試劑盒2×Taq PCR Mix、 DNA提取試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑 盒（SK8142），生工生物工程（上海）股份有限公司； 其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。PHSJ-3F型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；上海精宏MJP-250霉菌培養(yǎng)箱；ABI2720 PCR儀， 美國(guó)Bio-Rad公司；Scope. A1型光學(xué)顯微鏡，德國(guó)卡 爾·蔡司公司。

于 2015—2016 年對(duì)浙江省桐鄉(xiāng)市杭白菊生產(chǎn) 基地的葉枯病進(jìn)行了調(diào)查，將采集得到的32份病葉 樣品分別裝于無(wú)菌密封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。選取有典 型病斑的葉片，在病健交界處切取5 mm×5 mm大小 的組織塊，在75%乙醇中浸泡消毒5 s后用無(wú)菌水連 續(xù)漂洗3次，再用1%次氯酸鈉浸泡1 min后用無(wú)菌 水浸洗3次，放在滅菌濾紙上晾干后置于PDA平板 上。于 25℃恒溫黑暗培養(yǎng) 3 d 后，挑取菌落邊緣的 菌絲進(jìn)行純化培養(yǎng)，對(duì)分離所得的菌株進(jìn)行編號(hào)并 于PDA斜面保存。

從 1.2.1 中分離保存的菌株中隨機(jī)選擇 2 株菌 株，在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，25℃下黑暗培養(yǎng)7 d 后，用直徑 5 mm 的打孔器在菌落邊緣打取菌餅。 將健康無(wú)病且大小一致的現(xiàn)蕾期杭白菊葉片用無(wú)菌 水沖洗晾干后，再用無(wú)菌針頭刺傷葉片表面后將病 原菌菌餅接種至傷口處，置于 25℃、光照條件為 12 L∶12 D的培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)3 d，記錄發(fā)病情況。 以接種無(wú)菌PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理3次重 復(fù)。基于柯赫氏法則對(duì)接種3 d后發(fā)病葉片進(jìn)行病 原菌的再分離及純化，并與原接種菌株進(jìn)行比對(duì)。

將純化后的菌株分別接種至PDA和OMA平板 上，25℃下黑暗培養(yǎng) 6 d 后，再置于溫度為 25℃、光 照條件為12 L∶12 D的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，分別觀 察并拍照記錄平板上的菌落生長(zhǎng)形態(tài)及顏色，并在 顯微鏡下觀察病原菌的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)特 征。每株菌株隨機(jī)觀察10個(gè)視野，每個(gè)視野20個(gè)分 生孢子，共測(cè)量200個(gè)分生孢子的大小，以de Gruyter et al（. 1993）和Xu et al（. 2016）的標(biāo)準(zhǔn)作為分類鑒定 的形態(tài)學(xué)依據(jù)。

對(duì)32份具有典型病斑的杭白菊葉片樣品進(jìn)行病原菌分離，共純化獲得 35 株菌株，依據(jù)病害“葉 枯”拼音縮寫YK+采樣地點(diǎn)拼音縮寫+序號(hào)的原則 對(duì)其進(jìn)行命名，采樣地點(diǎn)包括緣緣菊業(yè)基地、李莊、 李家橋、顏井橋、港北、繞城路口、官樓，其拼音縮寫 分別簡(jiǎn)寫為YY、LZ、LJQ、YJQ、GB、RC、GL，無(wú)地點(diǎn) 編號(hào)的菌株均為桐鄉(xiāng)市區(qū)采集分離所得。隨機(jī)以YK-YJQ-10和YK-LJQ-3作為代表菌株 進(jìn)行致病性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，健康杭白菊葉片在回 接YK-YJQ-10和YK-LJQ-3菌株5 d后，葉片出現(xiàn)深 褐色圓形病斑，呈水漬狀，7 d后病斑繼續(xù)擴(kuò)大，連成 大病斑，葉片枯萎，而對(duì)照杭白菊的葉片只 出現(xiàn)褪綠，并無(wú)病斑。上述癥狀與采集到的 杭白菊田間自然發(fā)病癥狀一致。對(duì)病變 組織再次進(jìn)行病原菌的分離、純化，得到與接種菌株 YK-YJQ-10和YK-LJQ-3相同的病原真菌。滿足柯 赫氏法則，證實(shí)分離獲得的菌株確為杭白菊葉枯病 的病原菌。以杭白菊葉枯病病原菌的基因組DNA為模板， 以ITS、LSU和TUB2序列通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 分別產(chǎn)生556、1 045和499 bp的目的片段。將3個(gè)基 因序列經(jīng) MAFF 7.037b 和 GBLOCKS 0.91b 軟件進(jìn) 行多重比較及保守區(qū)域選擇，再利用Sequence Matrix 1.7.8軟件串聯(lián)成長(zhǎng)度為1 800 bp的基因聯(lián)合數(shù) 據(jù)集，串聯(lián)片段中基因順序?yàn)椋篒TS（1~478 bp）、LSU （479~1 469 bp）和 TUB2（1 470~1 800 bp）。串聯(lián)片 段序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，隨機(jī)選擇的YKYJQ-10、YK-YY-1、YK-LZ-9、YK-LZ-10、YK-LJQ-3 和YK-LJQ-4菌株與P. bellidis聚為一簇，結(jié)合 病原菌的形態(tài)學(xué)特征，最終將該病原菌鑒定為莖點(diǎn) 霉屬的P. bellidis。

葉枯病是影響杭白菊產(chǎn)量的主要葉片病害，本研究從浙江省桐鄉(xiāng)市采集得到具有典型葉枯病癥狀 的樣品，通過(guò)病害癥狀的系統(tǒng)觀察，病原菌的分離、 純化和致病性測(cè)定，結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)特征和分 子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，確定引起杭白菊葉枯病的病 原菌是莖點(diǎn)霉屬的 P. bellidis。該病原菌常侵染白 芷、雛菊、荸薺等植物，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì) （Lv et al.，2011；Xu et al.，2016）。而普通菊花上的 黑斑病是由殼針孢屬真菌菊殼針孢菌引起的（楊文 成，1996；張春桃等，2010）。說(shuō)明杭白菊上病害的病 原菌及發(fā)生流行規(guī)律很可能與普通菊花存在一定差 異。王呈輝等（2015）曾報(bào)道自浙江省磐安縣杭白菊葉枯病病葉中分離到的病原菌為尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum，病害癥狀主要為變色：葉片先端變 黃，再由局部擴(kuò)展到整個(gè)葉緣，呈褐色至紅褐色的葉 緣病斑；其后病斑逐漸向葉片基部蔓延，直至整個(gè)葉 片變?yōu)楹稚蚧液稚Ｍ暝撜n題組的馬婉琴等 （2015）報(bào)道同樣自磐安縣杭白菊葉枯病病葉中分離 到的病原菌為球毛殼菌Chaetomium globosum，主要癥狀為葉緣變色、卷曲，這也是球毛殼菌能引起植物 病害的首次報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)田間杭白菊葉枯病的 主要典型癥狀為褐斑及后期的連片黑斑，與菊花黑 斑病的癥狀類似，但與上述報(bào)道的2種真菌引起的 杭白菊葉枯病癥狀不同。表明杭白菊葉片上也可能 存在包括葉枯病在內(nèi)的幾種病害共同侵染，有待進(jìn) 一步系統(tǒng)調(diào)查和研究。



 

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